Renseignements sur les aliments nouveaux: Saccharomyces cerevisiae (levure brassicole) souche BY-989

Sur cette page

• Contexte
• Introduction
• Développement du microorganisme modifié
• Caractérisation du microorganisme modifié
• Informations sur le produit
• Exposition alimentaire
• Chimie
• Microbiologie
• Nutrition
• Toxicologie
• Allergénicité
• Conclusion

Contexte

Santé Canada a informé Berkeley Fermentation Science Inc. qu'il ne s'oppose pas à l'utilisation alimentaire de la souche génétiquement modifiée BY-989 de Saccharomyces cerevisiae (levure brassicole) pour conférer à la bière des saveurs et des arômes de fruits tropicaux en transformant les thiols conjugués sans saveur naturellement présents dans l'orge et le houblon en thiols libres. Les préparations commerciales liquides et séchées de cette souche seront vendues respectivement sous les noms de « Tropics London » et « Dry Tropics London » et sont destinées à remplacer la levure provenant d'autres sources commerciales disponibles dans la fermentation de la bière.

Santé Canada a mené une évaluation exhaustive de ces produits conformément à ses Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices reposent sur des principes internationalement reconnus visant à établir l'innocuité des aliments présentant des caractéristiques nouvelles.

Ce qui suit est un résumé de l'avis de Berkeley Fermentation Science Inc. et de l'évaluation menée par Santé Canada. Le présent document ne contient renseignement commercial confidentiel.

Introduction

La souche BY-989 a été génétiquement modifiée pour exprimer une enzyme lyase carbone-soufre (LCS) dérivée de Citrobacter freundii et modifiée par rapport à sa contrepartie sauvage. Dans la bière produite à l'aide de la souche BY-989, les arômes fruités proviennent de la présence de 3-mercaptohexanol (3MH) et d'acétate de 3-mercaptohexyle (3MHA). Le précurseur, le glutathion-3-mercaptohexan-1-ol (Glut-3MH), est converti en S-3-(hexan-1-ol)-L-cystéine (cys-3MH) par des enzymes transpeptidases natives, qui est ensuite transformé en 3MH par des enzymes LCS natives et recombinantes. Le 3MH ainsi obtenu est finalement converti en 3MHA par des enzymes alcools-O-acyltransférases natives.

Bien que la levure de bière exprime de manière endogène deux enzymes LCS, celles-ci se révèlent inefficaces pour convertir les précurseurs en 3MHA. En revanche, la LCS recombinante exprimée par la souche BY-989 augmente considérablement la concentration en 3MHA dans la bière comparativement à la souche brassicole commercialement disponible et utilisée pour son développement.

La Direction des aliments et de la nutrition est légalement responsable de l'évaluation préalable à la mise en marché des aliments nouveaux et des ingrédients alimentaires nouveaux, comme le prévoit le Titre 28 de la partie B du Règlement sur les aliments et drogues (aliments nouveaux). Les aliments dérivés des préparations de la souche BY-989 de S. cerevisiae sont considérés comme des aliments nouveaux en vertu de la partie suivante de la définition des aliments nouveaux:

« c) aliment dérivé d'un végétal, d'un animal ou d'un microorganisme qui, ayant été modifié génétiquement, selon le cas :

(iii) présente un ou plusieurs caractères qui ne se trouvent plus dans les limites prévues pour ce végétal, cet animal ou ce microorganisme. »

Développement du microorganisme modifié

L'espèce bactérienne utilisée comme organisme donneur, C. freundii, est couramment présente dans le tractus gastro-intestinal des humains en bonne santé. Cette espèce appartient au complexe C. freundii, qui comprend des membres identifiés comme des agents pathogènes nosocomiaux opportunistes émergents et rares. L'importance clinique des membres du complexe C. freundii tient moins au fait qu'ils provoquent des maladies spécifiques qu'à leur capacité modérée à développer une résistance au cours du traitement. Cependant, la séquence codante du gène LCS de C. freundii était synthétique, et aucun autre ADN provenant de l'organisme donneur n'a été utilisé dans le développement de la souche BY-989. Cette approche a écarté la possibilité que des gènes préoccupants provenant de C. freundii puissent être introduits dans la souche BY-989.

L'enzyme LCS de type sauvage issue de C. freundii possède à la fois des activités de lyase carbone-soufre et de tryptophanase. Cette dernière activité enzymatique entraîne la formation de traces d'indole, considérées comme sans danger pour la consommation humaine. Par exemple, le vin contient généralement 10 μg/L d'indole. La séquence codante de la LCS intégrée à la souche BY-989 présente cinq substitutions d'acides aminés par rapport à la séquence de sa contrepartie de type sauvage, et leur effet combiné réduit les activités de tryptophanase tout en augmentant la spécificité envers le cys-3MH. L'entreprise a démontré que la bière produite à l'aide de la souche BY-989 contient des concentrations d'indole similaires à celles de la bière fabriquée à partir de la souche hôte non modifiée, la London Ale Yeast (LAY), une souche brassicole disponible commercialement et largement utilisée dans la fabrication de la London ale.

La souche BY-989 de S. cerevisiae a été développée à l'aide d'une intégration génomique unique en utilisant la technologie d'édition génique. La souche hôte LAY a été co-transformée avec un fragment linéaire de la cassette d'expression LCS et un plasmide de co-transformation contenant une endonucléase ainsi qu'un ARN guide afin de permettre l'intégration génomique de la cassette LCS au locus souhaité. Le plasmide de co-transformation contenait également des gènes de résistance à la géneticine et à la kanamycine. Le gène de résistance à la kanamycine a été utilisé dans le cadre de la construction du plasmide de co-transformation, tandis que le gène de résistance à la géneticine a servi à la sélection des transformants positifs. Le plasmide de co-transformation a été conçu de manière à ne pas s'intégrer dans le génome de la cellule transformée.

Après la transformation, les cellules ont été ensemencées sur un milieu contenant de la géneticine afin de sélectionner les transformants, et une analyse par PCR a permis de repérer les transformants contenant l'insert intact au locus souhaité. Le passage des transformants sélectionnés sur des milieux non sélectifs a entraîné la perte du plasmide de co-transformation. Il a été confirmé que l'isolat sélectionné contenait la cassette d'expression LCS au locus ciblé et était dépourvu du plasmide de co-transformation, ce qui a été démontré par sa sensibilité à la géneticine. L'isolat sélectionné a été désigné sous le nom de souche BY-989.

Caractérisation du microorganisme modifié

Le requérant a caractérisé la souche BY-989 à l'aide d'une combinaison de techniques comprenant la PCR, le séquençage d'amplicons, ainsi que le séquençage du génome entier (WGS), des recherches BLAST et l'analyse des cadres de lecture ouverts (ORF).

Ensemble, ces analyses ont démontré que la cassette d'expression LCS intacte a été intégrée dans le génome à l'emplacement prévu. Une modification d'un seul nucléotide a été observée à l'extrémité 5' de la séquence du promoteur; toutefois, on ne s'attend pas à ce que cela pose un problème d'innocuité. La souche LAY étant tétraploïde (4n), l'entreprise a également confirmé que l'insert s'était intégré comme prévu sur les quatre chromosomes homologues. Le site d'insertion se trouvait dans une région intergénique, de sorte que les gènes natifs n'ont pas été perturbés. L'analyse des ORF a confirmé l'absence de protéines putatives non souhaitées résultant de l'intégration de l'insert. Aucune modification hors cible n'a été identifiée grâce à l'analyse WGS et des recherches BLAST subséquentes.

La stabilité des éléments génétiques intégrés a été déterminée par des passages en série de la souche BY-989 sur un milieu YPD (''yeast extract peptone dextrose'') afin d'atteindre plus de 100 cycles de doublement; à l'issue de ces passages, il a été confirmé que l'emplacement, l'orientation et la disposition des sites d'intégration étaient inchangés. Ces résultats ont confirmé la stabilité génétique de l'insert contenu dans la souche BY-989.

Les caractéristiques de croissance des souches LAY et BY-989 ont été comparées en termes de densité cellulaire et d'activité métabolique (consommation des intrants et production d'éthanol) au cours d'un cycle de production typique. Les deux souches ont présenté des performances de croissance similaires. Dans le cadre de l'analyse organoleptique, il a été rapporté que la bière brassée à l'aide de la souche BY-989 était plus souvent associée à des arômes et des saveurs tropicaux et fruités par rapport à la souche LAY, ce qui suggère que le phénotype visé a été obtenu comme prévu. Prises dans leur ensemble, ces données démontrent la stabilité phénotypique des caractéristiques développées dans la souche BY-989.

D'après les renseignements fournis, le Bureau de la salubrité alimentaire microbiologique et toxicologique n'a aucune préoccupation en matière d'innocuité concernant S. cerevisiae souche BY-989 d'un point de vue moléculaire.

Information sur le produit

Les préparations commerciales liquides et séchées sont produites par fermentation submergée d'une culture pure de S. cerevisiae souche BY-989 dans des conditions contrôlées. Après la fermentation, la biomasse est séparée du milieu de culture, ce qui donne la préparation liquide. Pour la préparation séchée, des étapes de déshydratation et de séchage sont mises en œuvre. Le requérant a indiqué qu'un bon processus de fabrication et un plan d'analyse des risques et de maîtrise des points critiques (HACCP) sont appliqués tout au long du processus de fabrication.

Exposition alimentaire

Au cours du brassage, la levure se dépose naturellement après la fermentation et est éliminée par des procédés standard tels que le soutirage. Par conséquent, seules des traces subsistent dans la bière finale consommée. Dans l'ensemble, l'exposition à la souche BY-989 devrait être minime et comparable à celle associée à la levure brassole conventionnelle.

Composition chimique

Le requérant a fourni des spécifications relatives à la teneur en plomb de la levure brassicole de souche BY-989, indiquant que cet ingrédient respectera la limite maximale de 1 ppm de plomb pour la levure séchée (levure de bière) établie dans le Codex des produits chimiques alimentaires. De plus, les concentrations estimées de plomb dans la bière résultant de l'utilisation de ce produit à base de levure dans les conditions proposées seraient conformes à la limite maximale de 0,2 ppm de plomb dans les boissons, telles qu'elles sont consommées, fixée par Santé Canada dans la Liste des contaminants et autres substances adultérantes dans les aliments.

À partir des spécifications fournies, la Section des contaminants alimentaires (SCA) a déterminé que l'utilisation proposée de la souche BY-989 ne devrait pas entraîner une augmentation de l'exposition alimentaire au plomb. Sur cette base, la SCA est d'avis que la souche BY-989 ne devrait pas poser de problème d'innocuité alimentaire du point de vue des contaminants chimiques.

Une liste des substances utilisées lors de la fabrication de S. cerevisiae souche BY-989 a été fournie par le requérant. Le requérant a déclaré que toutes les substances utilisées dans la fabrication de S. cerevisiae souche BY-989 étaient de qualité alimentaire et respectaient les spécifications respectives énoncées dans la plus récente édition du Codex des produits chimiques alimentaires et/ou du Répertoire des normes pour les additifs alimentaires établi par le Comité mixte FAO/OMS d'experts des additifs alimentaires.

Les ingrédients des milieux de fermentation ne sont généralement pas réglementés à titre d'additifs alimentaires et, en règle générale, le Règlement sur les aliments et drogues n'exige pas leur évaluation préalable à la mise en marché. D'après les renseignements fournis dans le cadre de l'avis, les substances provenant des milieux de croissance et de fermentation ne devraient pas demeurer dans le produit final.

Selon le requérant, le monostéarate de sorbitane est ajouté à la levure à une concentration de 0,8 à 1,2 % pendant le séchage, où il agit comme émulsifiant et contribue à maintenir la viabilité de la levure pendant le séchage et la réhydratation. Le monostéarate de sorbitane est un agent émulsifiant, gélifiant, stabilisant ou épaississant autorisé dans la levure séchée, à une concentration maximale de 1,5 %.

Le requérant a fourni les teneurs en 3MH et en 3MHA présentes dans la bière brassée à l'aide de S. cerevisiae souche BY-989, en les comparant à celles observées dans la bière et le vin commerciaux, produits à l'aide de souches de levure conventionnelles. Les données fournies montrent que les teneurs en 3MH et en 3MHA conférées à la bière par l'utilisation de S. cerevisiae souche BY-989 se situent dans l'Intervalle des teneurs observées dans la bière et le vin produits à partir de souches conventionnelles et qu'elles se situent dans les intervalles connues pour ces substances lorsqu'elles sont utilisées comme arômes dans les aliments. La Section des additifs alimentaires n'a aucune préoccupation quant aux teneurs en 3MH et en 3MHA produites dans la bière à la suite de l'utilisation de S. cerevisiae souche BY-989, telles qu'indiquées dans l'avis. Au Canada, les substances aromatisantes ne sont généralement pas assujetties à une autorisation préalable à la mise en marché. Néanmoins, l'utilisation de substances aromatisantes alimentaires, comme pour tout ingrédient utilisé dans la fabrication d'aliments, ne doit pas entraîner une violation de l'article 4 de la Loi sur les aliments et drogues.

Il incombe au fabricant et au distributeur de s'assurer que toute substance utilisée dans la fabrication de cette levure est conforme à toutes les exigences réglementaires. Cela comprend notamment de s'assurer que les additifs alimentaires utilisés dans la fabrication de la levure sont conformes aux dispositions énoncées dans le Règlement sur les aliments et drogues et dans les listes des additifs alimentaires autorisés; de s'assurer que toutes les matières utilisées dans la fabrication de la levure sont de qualité alimentaire, ou équivalente, et répondent aux spécifications appropriées en matière de qualité alimentaire. Comme pour tout aliment ou ingrédient alimentaire vendu au Canada, il incombe au requérant de s'assurer que son utilisation n'entraîne pas une infraction à l'article 4 de la Loi sur les aliments et drogues.

Le Bureau d'innocuité des produits chimiques n'a relevé aucun risque chimique pour l'innocuité des aliments lié aux utilisations proposées de la levure de bière S. cerevisiae souche BY-989.

Microbiologie

Le requérant a établi des spécifications microbiologiques distinctes pour les formats liquide et séché de S. cerevisiae souche BY-989. La préparation liquide doit contenir plus de 95 % de cellules viables et ne contenir aucune bactérie ni levure sauvage détectable par 10⁶ cellules de la préparation. Pour la préparation séchée, la viabilité doit être supérieure à 5 × 10⁹ UFC/g; Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. et Listeria monocytogenes doivent tous être absents dans des échantillons de 25 g, et les levures sauvages, les bactéries lactiques et les bactéries acétiques doivent être en nombre inférieur à 10⁴ UFC/g. Des méthodes reconnues à l'échelle internationale ont été utilisées pour vérifier la conformité aux spécifications microbiologiques établies.

La souche BY-989 est actuellement fabriqué sous forme liquide aux États-Unis. Le requérant a indiqué avoir récemment élargi sa gamme de produits pour y inclure une version séché, dont un seul lot a été produit jusqu'à présent. Par conséquent, l'entreprise a fourni des certificats d'analyse pour trois lots non consécutifs de la préparation liquide et un lot de la préparation séchée.

D'après les résultats fournis, les spécifications microbiologiques fixées pour la forme liquide ont été respectées dans plusieurs lots non consécutifs, ce qui confirme la production constante d'un produit sécuritaire sur le plan microbiologique. Les résultats obtenus pour un seul lot de la forme séchée étaient également conformes aux spécifications établies. L'analyse d'un seul lot de la préparation séchée ne soulève pas de préoccupation en matière d'innocuité, étant donné que l'on ne s'attend pas à ce que les étapes de fabrication qui différencient la préparation liquide de son équivalent séchée n'introduisent des risques microbiologiques et que des ingrédients de qualité alimentaire sont utilisés. De plus, le requérant a confirmé que seuls les lots répondant aux spécifications établies seront mis en vente.

D'après les renseignements fournis, le Bureau de la salubrité alimentaire microbiologique et toxicologique n'a aucune préoccupation en matière d'innocuité concernant S. cerevisiae souche BY-989 d'un point de vue microbiologique.

Nutrition

La souche BY-989 peut être utilisée de la même manière que n'importe quelle levure brassicole commerciale et peut remplacer n'importe quelle souche de S. cerevisiae actuellement utilisée dans la fermentation de la bière.

La bière n'est généralement pas consommée pour sa valeur nutritionnelle. Par conséquent, d'un point de vue nutritionnel, il n'a pas été jugé nécessaire d'exiger des données sur la composition comparant la bière fabriquée avec la souche BY-989 à celle fabriquée avec une levure brassicole traditionnelle.

Le substrat (orge et houblon), la levure et l'enzyme (présentes naturellement dans le système gastro-intestinal de la plupart des humains), ainsi que les produits de réaction, sont tous couramment consommés dans le cadre de l'alimentation et ne soulèvent donc aucune préoccupation nutritionnelle.

Le Bureau des sciences de la nutrition n'a relevé aucune préoccupation nutritionnelle liée à l'utilisation proposée de S. cerevisiae souche BY-989 pour augmenter les concentrations de thiols dans la bière finie.

Toxicologie

Aucune étude de toxicité ni aucune étude clinique portant sur l'aliment nouveau S. cerevisiae souche BY-989 n'a été soumise. Toutefois, une approche fondée sur le poids de la preuve a été considérée, en se basant sur les éléments suivants.

La souche hôte (London Ale Yeast) présente un antécédent d'utilisation sécuritaire comme aliment, confirmée par des décennies d'utilisation dans la production commerciale de bière. En ce qui concerne le microorganisme donneur, la Section d'évaluation toxicologique préalable à la mise en marché a estimé que la séquence codant pour la protéine LCS de C. freundii avait été synthétisée de manière synthétique et qu'aucun autre ADN provenant de l'organisme donneur n'avait été utilisé dans le développement de la souche BY-989, ce qui exclut donc le risque que des gènes préoccupants provenant de C. freundii soient transférés dans le génome de la souche BY-989.

De plus, d'après une analyse in silico jugée acceptable, la protéine LCS ne présente aucune homologie de séquence en acides aminés avec des toxines connues. Par ailleurs, on ne s'attend pas à ce que la protéine LCS soit présente à des concentrations significatives dans la bière finie, car elle est produite de manière intracellulaire et la plupart des levures sont éliminées de la bière dans le cadre du processus de brassage standard.

Pour toutes ces raisons, l'absence d'études de toxicité a été jugée acceptable dans ce cas.

Les produits de réaction de la LCS (3MH et 3MHA) sont reconnus comme ingrédients aromatisants alimentaires par la Section des additifs alimentaires et, en vertu du Règlement sur les aliments et drogues, il n'existe aucune limite quantitative quant à l'utilisation des substances aromatisantes, à condition que leur utilisation soit conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF). La Section des additifs alimentaires a confirmé que les concentrations en 3MH et en 3MHA relevées dans la bière produite à partir de la souche BY-989 se situent dans les limites habituellement associées à l'utilisation d'arômes. Sur la base de ces constatations, la Section d'évaluation toxicologique préalable à la mise en marché a déterminé qu'il n'était pas nécessaire de mener une évaluation d'innocuité toxicologique pour le 3MH ou le 3MHA. De plus, le Comité mixte FAO/OMS d'experts des additifs alimentaires a déterminé que ces deux composés ne présentent aucun risque pour la santé aux niveaux d'apports actuels lorsqu'ils sont utilisés comme agents aromatisants.

D'après les renseignements fournis, la Section d'évaluation toxicologique préalable à la mise en marché n'a relevé aucun risque toxicologique pour l'innocuité alimentaire lié à l'utilisation de S. cerevisiae souche BY-989 par rapport à celle d'autres souches de S. cerevisiae déjà utilisées dans le brassage.

Allergénicité

Le requérant a effectué une recherche d'homologie de séquences à l'aide de la base de données AllergenOnline afin d'identifier une éventuelle réactivité croisée entre l'enzyme LCS et des allergènes connus. La recherche dans la base de données n'a révélé aucun alignement atteignant ou dépassant le seuil de > 35 % sur une fenêtre glissante de séquences de 80 acides aminés, ni celui de 100 % sur 8 acides aminés, ces deux critères étant conformes aux lignes directrices de l'OMS/FAO.

Aucune homologie significative entre l'enzyme LCS et des allergènes alimentaires connus ou présumés n'a été identifiée.

La Section d'évaluation toxicologique préalable à la mise en marché n'a révélé aucun risque allergénique lié à l'utilisation de S. cerevisiae souche BY-989.

Conclusion

L'examen effectué par Santé Canada des informations présentées à l'appui de l'utilisation de Saccharomyces cerevisiae souche BY-989 pour remplacer les levures provenant d'autres sources commercialement disponibles dans la fermentation de la bière ne soulève aucune préoccupation liée à l'innocuité des aliments.

Le présent document d'information sur les aliments nouveaux a été préparé afin de résumer l'avis concernant le produit en question émis par la Direction des aliments et de la nutrition, Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada. Cet avis repose sur un examen exhaustif des renseignements soumis par le requérant conformément aux Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux.

Pour de plus amples renseignements, veuillez communiquer avec :

Section des aliments nouveaux
Direction des aliments et de la nutrition
Direction générale des produits de santé et des aliments
Santé Canada, PL2204A1
251, Promenade Frederick Banting
Ottawa, Ontario K1A 0K9
bmh-bdm@hc-sc.gc.ca